یک جدا سازی خوب چه مشخصاتی باید داشته باشد؟

آن چیزی که در جداسازی به روش کروماتوگرافی مد نظر می باشد، به دست آوران تفکیک قابل اجزاء نمونه در کوتاه ترین زمان است. در کنار تفکیک مناسب شکل پیک های حاصله نیز اهمیت دارد. به طوری که پیک های متقارن، تیز و بدون دنباله از مشخصه های یک جداسازی موفق می باشد.

تفکیک (Rs) میزان جدا سازی نمونه ها از یکدیگر را نشان می دهد و از رابطه ذیل قابل محاسبه می باشد.

مقادیر پهنای پیک در نصف ارتفاع و زمان بازداری مطابق شکل ذیل از کروماتوگرام قابل اندازه گیری می باشد. حداقل تفکیک برابر 1/5 می باشد.

نکته مهم دیگری که در قضاوت در جداسازی باید مد نظر داشت، خلوص پیک ها ( Peak Purity) می باشد. به این معنا که باید یقین داشت که هر پیک مربوط به یک نمونه می باشد. به عبارتی دیگر زیر پیک حاصله پیک جزء دیگری پنهان نباشد که این موضوع از ظاهر کروماتوگرام مشخص نیست. بعنوان مثال این مسئله در مطالعات پایداری که پیک حاصل از تخریب ( Degradation  ( نمونه دارویی ممکن است در جایی ظاهر شود که پیک نمونه دارویی پدیدار می گردد، بسیار اهمیت دارد که می تواند نتایج پایداری را وارونه تفسیر نماید. در واقع در آنالیز به روش کروماتوگرافی از روی کروماتوگرام می توان در مورد جداسازی بد قضاوت کرد ولی در مورد جداسازی خوب این مسئله تعمق بیشتری را طلب می کند، به عنوان مثال به کروماتوگرام محلول ترتینوئین و مینوکسیدیل توجه فرمائید.

بر اساس این کروماتوگرام تفکیک پیک از یکدیگر خوب ، زمان آنالیز مناسب و شکل پیک ها مطلوب می باشد ولی این جداسازی خوب تعریف نمی شود. چرا که در یک شرایط کروماتوگرافی جدید کروماتوگرام قبلی به صورت ذیل در می آید.

 

این موضوع نشان می دهد که زیر پیک ترتینوئین در کروماتوگرام اول پیک دیگری پنهان شده بود، که در شرایط جدید کروماتوگرافی، خود را نشان داده است. این پیک در کروماتوگرام دوم مربوط به ایزوترتینوئین می باشد که خصوصا در مطالعات پایداری از ایزومریزاسیون ترتینوئین حاصل می شود و چون از نظر شیمیایی ایزومرترتینوئین می باشد، لذا احتمال ظاهر شدن در جایی که ترتینوئین آمده است را دارد. این مثال در واقع موضوع Peak Purity را نشان می دهد. از این رو در آنالیز به روش کروماتوگرافی، هر پیک باید مربوط به یک جزء باشد. برای تشخیص این مطالب توصیه می شود، کروماتوگرام را حداقل در دو سیستم کروماتوگرافی ( متفاوت از نظر فاز متحرک یا فاز ساکن) به دست آورده و در صورتی که پیک های جدید ظاهر نشدند به این معنا است که پیک های حاصله از خلوص مورد نظر برخودار باشند.

حال که با مفهوم جداسازی خوب آشنا شدیم، یه سوالی که مطرح است، این است که در صورتی که جداسازی مطلوب اتفاق نیفتد، چه تمهیداتی باید اتخاذ گردد تا مقصود حاصل گردد.

گام به گام با جدا سازی موفق

اولین تغییری که باید در جهت بهبود جداسازی انجام داد، تغییرات فاز متحرک می باشد. در صورتی که نتیجه مطلوب حاصل نگردد، تغییرات فاز ساکن گام بعدی است و در صورت عدم موفقیت تمهیداتی دیگر نظیر تغییراتی در نحوه نمونه سازی، تعویض دتکتور و یا استفاده از تکنیک های دیگر کروماتوگرافی باید مد نظر قرار گیرد.

باید توجه داشت که تغییرات فاز متحرک ابتدایی ترین اقدام در جهت دستیابی به جداسازی خوب می باشد که در این مقاله به آن پرداخته خواهد شد. در مقاله بعدی، تغییرات فاز ساکن بحث خواهد شد و در مقالات آتی تمهیدات ویژه دیگر بحث خواهد گردید ولی باید توجه داشت که عمدتا با تغییرات فاز متحرک و ساکن این مسئله قابل حل خواهد بود و کمتر سایر تمهیدات مورد توجه قرار خواهند گرفت. با این وجود این موضوع نیز مورد بررسی قرار خواهد گرفت تا خصوصاً خوانندگان محترمی که بحث را تخصصی تر دنبال می نمایند با این سری از تمهیدات آشنا شوند.

 

تغییرات فاز متحرک

تغییرات فاز متحرک می تواند شامل سرعت جریان فاز متحرک، pH  فاز متحرک، ترکیب درصد فاز متحرک ، نوع حلال متشکله فاز متحرک و نیز میزان و نوع مواد افزودنی در فاز متحرک باشد.

در یک آنالیز چنانچه جداسازی خوبی اتفاق نیفتد، اولین گام در جهت بهبود جداسازی سرعت جریان فاز متحرک می باشد، باید توجه داشت که اگر ایراد جداسازی در میزان تفکیک پیک ها باشد، یعنی پیکها با هم تداخل داشته باشند، کاهش جریان فاز متحرک می تواند مؤثر باشد. چرا که در سرعتهای پایین تفکیک پیک ها از یکدیگر بهتر است ولی باید توجه داشت که کاهش سرعت باعث پهن شدن پیک ها می گردد. از این رو بالاترین سرعتی که بهترین جداسازی را می دهد، سرعت مطلوب به حساب می آید.

از طرفی دیگر اگر مشکل جداسازی، زمان طولانی آنالیز و یا پهن بودن پیک ها باشد. این مسئله میتواند با افزایش سرعت جریان فاز متحرک مرتفع گردد. البته باید توجه داشت که در سرعت های بالا، فشار پمپ بالا می رود و این مسئله خصوصا در مواردی که از بافرها استفاده می شود، می تواند بعضا مشکل ساز باشد.

خلاصه این که یک آنالیست باید توجه داشته باشد که تغییر سرعت فاز متحرک اولین گام در دستیابی جداسازی خوب محسوب می شود و بر حسب کیفیت جداسازی افزایش و یا کاهش سرعت می تواند کمک کننده باشد.

چنانچه تغییر سرعت جریان فاز متحرک منجر به جداسازی ایده آل نگردید، توصیه میشود در سرعتی که جداسازی حداکثر می باشد توقف کرده و برای جداسازی به ترکیب درصد حلال توجه نمود.

به عبارتی دیگر آنالیست باید متوجه باشد که افزایش قطبیت باعث بهبود جداسازی میشود یا کاهش قطبیت؟ مثلا اگر مخلوط آب و متانول داشته باشد، پر واضح است که افزایش سهم آب به منزله افزایش قطبیت فاز متحرک و افزایش متانول به منزله کاهش

قطبیت به حساب می آید.

 بدیهی است اگر کروماتوگرافی معکوس (Reverse Phase) مد نظر باشد، باید توجه داشت که افزایش قطبیت فاز متحرک ( افزایش آب) باعث طولانی شدن زمان بازداری ها شده و زمان آنالیز طولانی تر و میزان تفکیک بهتر خواهد شد. از این رو باید سهم آب تا جایی اضافه شود که بهترین میزان تفکیک با حداقل زمان آنالیز حاصل گردد. برعکس افزایش میزان متانول باعث شستشو بهتر نمونه ها در فاز معکوس شده و پیکها به یکدیگر نزدیک تر و زمان آنالیز کوتاه تر می شود. یعنی چنان چه مشکل جداسازی فواصل زیاد پیکها و زمان طولانی آنالیز بود، این اقدام می تواند چاره ساز باشد.

بدیهی است که این موضوع در مورد فاز نرمال برعکس می باشد. یعنی افزایش قطبیت حلال باعث شستشوی بهتر نمونه ها و کوتاهتر شدن زمان آنالیز می گردد. اگر نحوه تاثیر قطبیت فاز متحرک بر روی زمان بازداری و در نتیجه جداسازی فراموش گردید، این موضوع با آزمایش ساده نیز عملی می باشد. مثلا در مخلوط آب و متانول توصیه می شود یک بار سهم آب (افزایش قطبیت) و یک بار سهم متانول (کاهش قطبیت) افزایش یابد و در نهایت تاثیر ترکیب درصد حلال در روند جدا سازی مشخص گردد تا بتوان از آن در بهبود روند جداسازی استفاده گردد.

بعد از ترکیب درصد حلال، pH فاز متحرک نیز موضوع مهمی است که میتواند در روند جداسازی بسیار تاثیر گذار باشد. برای آن که پیش از تغییرات pH اثرات آن را در روند جداسازی حدس بزنید بهتر است به ساختمان شیمیایی جسم مورد آنالیز توجه داشته باشید. اجسامی که دارای گروه های اسیدی نظیر کربوکسیلیک اسید، فنل و یا تیوفنل هستند و نیز اجسامی که دارای گروه های بازی نظیر گروه های آمین هستند. در مقابل تغییرات حساس هستند و می توان با تغییر pH جداسازی را تحت الشعاع قرار داد. این موضوع خصوصا در تیز کردن پیکها و در نتیجه تفکیک بهتر مؤثر می باشد.

اقدام بعدی در صورت عدم موفقیت، تغییرات فاز متحرک از نظر نوع حلال میباشد. اقداماتی نظیر تعویض متانول با استونیتریل در نظر گرفتن تتراهیدروفوران به عنوان بخشی از فاز متحرک و افزودن مواد خاص به فاز متحرک از اقدامات بعدی می باشد در مورد نوع حلالها دانستن اطلاعاتی در مورد شاخص قطبیت (P) مهم می باشد.

شاخص قطبیت چند حلال پر مصرف در کروماتوگرافی در جدول ذیل نشان داده شده است.

‘P	حلال
۴/۲ ۴/۸ ۶/۲ 6/۸ ۹/0	تتراهیدروفوران دی اکسان استونیتریل متانول آب

به عنوان مثال شاخص قطبیت مخلوط ۵۰ آب و ۵۰ متانول به شرح ذیل است:

7/8=(0/5*6/8)+(0/5*9)

لذا مثلا اگر با مخلوط بالا جداسازی ایده آلی اتفاق نیفتد، می توان نوع حلال را تغییر داد و لیکن شاخص قطبیت تغییری نکند. مثلا %75 آب و %25 تتراهیدروفوران نیز شاخص قطبیت 8/7 دارد ولیکن جداسازی این دو با هم فرق میکند.

به مثال ذیل توجه کنید:

فاز متحرک: (1) متانول / آب 50:50    (2) تتراهیدروفوران / آب 75:25

 

 

همان طور که مشخص است در کروماتوگرام دوم جداسازی خوب می باشد. به طور کلی وقتی نوع حلال قرار است تغییر کند، شاخص قطبیت حلال جدید نباید با حالت قبلی تفاوت بارزی داشته باشد تا بتوان به ترکیب درصد ایده آل بهتری رسید. مثلا در مثال بالا ابتدا نوع حلال به گونه ای تغییر میکند که شاخص قبلی حاصل گردد. اگر جواب مطلوب حاصل نشد ترکیب درصد حلال جدید مشابه حالت تغییر ترکیب درصد تغییر می یابد تا به جداسازی خوب برسیم تغییرات نوع حلال خصوصا در مواردی که تفکیک مشکل دارد. مد نظر قرار می گیرد. گاهی موادی به فاز متحرک اضافه میشود که به بهبود جداسازی کمک می کند. این مواد افزودنی خصوصا مواقعی اضافه می شود که پیک پهن و زمان آنالیز طولانی می باشد. از جمله این مواد می توان به باز رقابتی نونیل آمین اشاره کرد که باعث کاهش زمان آنالیز و تیز شدن پیک ها می گردد. باید توجه داشت که این مواد در مقادیر بسیار کم به فاز متحرک اضافه می شوند ولی بسیار تاثیر گذار هستند.

 در مثال ذیل که هدف جداسازی ۷ تری سیکلیک ضد افسردگی می باشد. (کروماتوگرام زیر )، با افزودن نونیل آمین پیک ها فشرده تر (زمان آنالیز کوتاه تر) و نیز تیزتر شده است.

ستون: فاز C8  پیوندی. ابعاد( میلیمتر 4.6 *15 سانتی متر)

فاز متحرک(1)   MeCN —–  0/01 M H3PO4 در pH=2 تعدیل شده با KOH

فاز متحرک(2)  نونیل آمین 0/005  + MeCN —–  0/01 M H3PO4 در pH=2/5

سرعت عبور= 2 سانتیمتر مکعب در دقیقه

نمونه= 1-نوردکه پین 2- دوکه پین  3- دسی پیرامین  4- پروتریپتکن  5- ایمیپرامین  6- نورتیریپتلین  7- آمی تریپتلین

 

 

در خاتمه چنانچه تغییرات فاز متحرک چاره ساز نبود باید به تغییرات فازساکن اندیشید که در مقاله بعد به آن اشاره می شود.