عواملی که در جداسازی به روش HPLC موثر هستند:

• سرعت جریان فاز متحرک:

در سرعت ‌های پایین، تفکیک پیک‌ها از یکدیگر بهتر است ولیکن در سرعت‌های پایین پیک‌ها پهن می‌شوند و نیز زمان آنالیز طولانی می‌شود، بنابراین بالاترین سرعتی که بهترین جداسازی را سبب می‌شود سرعت مطلوب محسوب می‌شود.

• فاز متحرک:

میزان قطبیت فاز متحرک (نوع و ترکیب درصد حلال) تاثیر بسیاری در جداسازی دارد. در HPLC  می بایست تاثیر قطبیت بر زمان بازداری اجزای مخلوط و در نتیجه جداسازی مشخص گردد، یعنی اینکه باعث مشخص شود که اگر قطبیت فاز متحرک بیشتر و کمتر شود، نتیجه جداسازی چه خواهد بود تا بتوان در آن جهت به منظور بهبود جداسازی گام برداشت. از طرف دیگر pH فاز متحرک نیز میتواند در جداسازی و خصوصا در شکل پیک ها موثر باشد که این موضوع خصوصاً برای داروهای حساس به pH که گروه آمینی، اسیدی و یا فنولی دارند، بسیار ملموس می‌باشد لذا یافتن ترکیب حلال و نیز pH مطلوب ( محدوده ۲ تا ۸ ) از ارکان اساسی در دستیابی به یک جداسازی مطلوب می‌باشد.

• فاز ساکن:

ماهیت فاز ساکن (قطبیت فاز ساکن) و نیز ابعاد ستون و نحوه پر شدن فاز ساکن (Packing) در جداسازی بسیار موثر است. به طوری که انتخاب فاز ساکن ( نرمال یا معکوس) و نیز طول و اندازه ذره ای  مناسب، از ارکان مهم در جداسازی محسوب می گردد. پر واضح است که ستونهای با طول بلند و قطر کمتر و اندازه ذره ای کم جداسازی بهتری را باعث می شوند.هر چند که زمان آنالیز افزایش می‌یابد از این رو باید بین ابعاد ستون و جداسازی تناسبی وجود داشته باشد که هم جداسازی مطلوب باشد هم زمان آنالیز طولانی نگردد .

• دتکتور:

دتکتورهای مورد استفاده در HPLC  عمدتاً ماورای بنفش بوده ولیکن فلورسانس و الکتروکمیکال نیز بر حسب نوع کار استفاده می‌شوند. اصولاً انتخاب نوع دتکتور از اصول اولیه کار با HPLC  می‌باشد و می‌بایست قبل از انجام کار عملی گزینش نوع دتکتور انجام پذیرد.  این گزینش بر پایه ساختمان شیمیایی ماده و نوع آنالیز مورد نظر می‌باشد.

اصولاً نبایستی بهبود جداسازی منوط به دتکتور گردد ولی با توجه به اینکه بعضی از دتکتور ها از قابلیت انتخاب بیشتری برخوردار هستند (نظیر فلورنسانس) می توانند در ایجاد کروماتوگرام های خلوت تر و در نتیجه بر روند جداسازی موثر باشند. در نهایت توصیه می‌شود انتخاب نوع دتکتور  ابتدای کار صورت پذیرد و جداسازی وابسته به تغییرات فاز ساکن و متحرک شود.

توسعه روش کروماتوگرافی Method development 

توسعه روش کروماتوگرافی خصوصاً برای داروهایی که در فارماکوپه نمی‌باشند، بسیار مهم می‌باشد. جهت توسعه یک روش ابتدا می‌بایست ساختمان شیمیایی اجزای مخلوط را که قرار است جداسازی روی آن انجام شود بررسی گردد برای مثال فرض کنید هدف توسعه یک روش جداسازی سه استروژن زیر در قرص می باشد.

ابتدا می‌بایست به ساختمان‌ها توجه کنید و در شروع کار، نوع دتکتور را مشخص نمایید. با توجه به ساختمان های بالا دتکتور UV  مناسب می‌باشد. چرا که هر سه جز دارای جذب UV   به واسطه داشتن حلقه فنیلی می‌باشند. قدم دوم انتخاب ستون می‌باشد. یعنی در واقع می­بایست نوع ستون را از نظر قطبیت مشخص نماییم، این امر وابسته به ساختمان شیمیایی می­باشد. همانطور که در شکل بالا نشان داده شده است، ساختمان های بالا از یک بخش غیرپلار و نیز یک سری گروه‌های پلار تشکیل شده اند. یعنی هم قابلیت چسبیدن به ستون‌های غیر قطبی را از طریق بخش‌های غیر قطبی دارند هم می‌توانند به ستون‌های قطبی با گروه‌های قطبی موجود در ساختمان خود بچسبند. اما همانطور که از مقایسه ساختمان‌های شیمیایی پیداست سه جز فوق از نظر بخش‌های غیر قطبی با هم متفاوت می‌باشند ولی از لحاظ بخش قطبی مشابه ­اند، لذا ستون غیر قطبی اختلافات بین اجزا را بهتر نشان میدهد از این رو میبایست از ستون غیر قطبی ستون C₁₈ یعنی سیستم فاز معکوس استفاده کرد که به عنوان نمونه در شروع کار که فاز معکوس مد نظر است انتخاب اول می باشد. حال که ستون مشخص کردید می بایست فاز متحرک انتخاب گردد از آنجایی که فاز متحرک از نظر ماهیت مخالف فاز ساکن می‌باشد، لذا در صورت انتخاب ستون های غیر پلار نظیر نظیر  C₁₈ از فاز متحرک قطبی نظیر متانول آب و یا استونیتریل استفاده نمود.

انتخاب اول در توسعه روش مخلوط آب و متانول به نسبت ۵۰ :۵۰ ‌باشد پر واضح است که نمونه هر شکلی که باشد می‌بایست به صورت محلول شفاف در بیاید. اولین تزریق در اصل یک شکست است، یا جداسازی نداریم یا بسیار کم می‌باشد.

 در شکل زیر تزریق اول نشان داده شده است.

همانطور که در شکل نشان داده شده است، تمام اجسام زود و با یکدیگر از ستون بیرون آمده اند. لذا می‌بایست تدبیری اندیشید که زمان بازداری افزایش یابد. شما این کار را توسط کدام یک از روش‌های زیر انجام می‌دهید؟

۱. افزایش میزان متانول در فاز متحرک؟

۲. افزایش مقدار آب در فاز متحرک ؟

۳. تعویض فاز متحرک با استونیتریل و آب؟

راه افزایش زمان بازداری در ستون‌های فاز معکوس افزایش قطبیت فاز متحرک می باشد. لذا می‌بایست درصد آب فاز متحرک را افزایش داد. مثلاً اگر از مخلوط 50:50 آب و متانول به مخلوط 35:65 آب و متانول برسیم و تزریق نماییم نتیجه به صورت زیر خواهد شد.

شکل فوق نشان می‌دهد که پیک اجزا از هم بازتر شده‌اند و در ضمن بازداری، کمی بیشتر شده است. لذا جهت حرکت درست می باشد یعنی می‌بایست افزایش قطبیت را ادامه دهیم تا به جداسازی برسیم یعنی گام بعدی مخلوط 20:80 آب متانول است شکل زیر نتیجه تزریق مخلوط 20:80 آب و متانول می‌باشد.

اگرچه جداسازی ایده‌آل نیست ولی در مقایسه با ترکیب درصد فاز متحرک قبلی بهتر است. لذا افزایش قطبیت خوبی برای جداسازی می‌باشد بعد از مخلوط 20:80 آب متانول، قاعدتاً بایستی ترکیب 0:100 داشته باشیم که البته این ترکیب درصد عاقلانه ای نیست، چرا که این ترکیب درصد که تماماً آب می‌باشد نمی‌تواند استروئیدها را که مولکول های آلی هستند، شستشو دهد، لذا وجود درصدی متانول لازم است از این رو بعد از ترکیب درصد 20:80 توصیه می‌شود با افزودن نمک، یعنی استفاده از بافر به جای آب، قطبیت را افزایش داد. از این رو مثلاً محلول 0.001 مولار فسفات دی هیدروژن پتاسیم به جای آب استفاده می‌کنیم، یعنی متانول ۲۰ درصد داریم ولی ۸۰ درصد آب با آب نمکدار که قطبی‌تر می‌باشد جایگزین شده است نتیجه به صورت زیر خواهد شد.

این مسئله نشان می‌دهد که در چنین ترکیب درصدی استروژن‌ها برخلاف ترکیب 20:80 آب  متانول از ستون خارج نشده اند. لذا قطبیت زیاد شده است خوب در این حالت چه باید کرد؟

 می‌توان نمک را در نظر گرفت ولی این بار درصد متانول را افزایش داد تا استروژن‌ها شستشو گردد و ستون بیرون بیان لذا پله پله ترکیب درصد بافر متانول در جهت افزایش سهم متانول افزایش می‌دهیم به طوری که در شکل زیر نشان داده شده است مخلوط بافر متانول ۵۰:۵۰ بهترین را نشان می‌دهد.

باز جداسازی ایده‌آل نیست بدیهی است در این حالت که با تغییر حلال وضع بدتر می‌شود. روی بهترین ترکیب درصد ایستاده و حالا تغییرات را متوجه عوامل دیگر جداسازی می‌کنیم بعد از تغییرات تغییرات فاز ساکن مدنظر می‌باشد به طوری که ابتدا طول ستون را بیشتر می‌کنیم اگر جواب نداد اندازه ذره‌ای را کم می‌کنیم در غیر این صورت نوع ستون را (البته از نوع فاز معکوس) تعویض می‌کنیم در شکل زیر طول ستون دو برابر شده است و نتیجه‌ ایده آل حاصل شده است.

 

منبع: منشور توان (ماهنامه علمی تخصصی دارویی پزشکی)